流式细胞仪常见问题的处理方法及技术交流

　　【***** 维修保养】流式细胞仪是一种对细胞进行自动分析和分选的装置，依据参数测量试验方法工作。流式细胞仪主要由流动室和液流系统、激光源和光学系统、光电管和检测系统、计算机和分析系统4部分组成，目前在生物医疗领域有广泛运用，主要用于分析细胞表面标志、分析细胞受体、分析肿瘤细胞的DNA、RNA含量、分析免疫细胞的功能。　　对于精密仪器而言，故障的出现在所难免，如何排查故障是延长仪器寿命的关键。流式细胞仪常见的故障主要有仪器长时间不能进入ready状态、喷嘴堵塞两个。　　仪器长时间不能进入ready状态　　仪器长时间不能进入ready状态可能是试管有裂缝导致漏气、鞘液罐的接口漏气、喷嘴上的胶圈破损及老化、电源部分有故障，应遵循由简到难的顺序逐一排查，替换问题组件，如果仍然无法进入ready状态，需请厂家来维修。　　喷嘴堵塞　　喷嘴堵塞一般出现在实机操作中。日常的喷嘴在prime机时喷出一道水柱，如果喷出的是气泡，则说明喷嘴有堵塞，气泡越大堵塞越严重。排除故障的步骤：①放开托臂，用10%的次氯酸钠反复冲洗再放回托臂机，如果故障还未排除就应关掉主机。②用的注射器接上胶管套，在喷嘴上反复抽吸，一般堵塞现象可以排除。③如果注射器抽吸无效，则要小自取下喷嘴。此操作应由厂家的维修人员或熟练的工作人员进行，以免撞弯了喷嘴。喷嘴用注射器套上冲洗，直至喷嘴喷出的水柱呈直线为止。④如果喷嘴堵塞经上述淀查病后的水柱呈直线为止。④如果喷嘴堵塞经上述3个步骤还不能解决，可以用超声波仪清洗。清洗时喷嘴两头应套上试管，以防碰弯。先将喷嘴浸入的10%次氯酸钠中超声1h，然后用过滤后H2O的再超声1h，经过此步骤清洗的喷嘴都会**堵塞现象。注意不到万不得己时不要拆下喷嘴清洗，因为反复的拆卸会增加喷嘴损坏的可能性。 流式细胞仪的十大应用

　　1、DNA倍体分析　　DNA分析是流式细胞仪***初且是现在应用***广检测项目。由于恶性细胞DNA含量通常与正常细胞不同，存在异倍体细胞，所以现有很研究评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系。DNA含量检测还可提供细胞周期方面的信息，这在细胞生物学中运用很广泛。特别地，它可表示出细胞毒性**对细胞作用过程。这些DNA检测还可与细胞表面标志物标记同时进行，这样在细胞混合培养中，可通常追踪表达特异标志物的细胞显示其生长周期情况。所有方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光，常用的染料为PI，DAPI。　　在该领域Partec公司的 CyFlow PA是一枝独秀。　　2、细胞生存能力实验　　使用Heochest 33342染料与DNA特异性结合，后因细胞活力不同染料的结合程度也各异，故可评估细胞的活性度。　　3、计数外周血中检测网织红细胞　　使用TO染料能够特异性地与RNA结合，结合系数高达3000，故具有很好的性价比。　　4、外周血、骨髓采集物中CD34阳性干细胞计数，临床上用于骨髓移植前干细胞数理的测定。使用标准ISHAG方案，需要DNA或其他核染料占用FITC通道，PE标记CD34抗体，PE-CY5标记CD45抗体。　　5、交叉淋巴细胞、粒细胞毒实验　　检测识别供体血清中免疫球蛋白与受体粒细胞之间是否存在反应有着重要临床意义，因为这种反应会导致移植后发热、移植后肺损伤及免疫性粒细胞缺乏症。流式细胞仪可检测全血样本与血清孵育后粒细胞上结合的人免疫球蛋白。FITC标记人免疫球蛋白抗体、PE标记粒细胞表面标志物、PE-CY5标记HLA抗体。　　6、血小板自身抗体检测　　血小板自身抗体识别人血小板抗原，会引起各种临床相关症状，如新生儿自免性血小板减少症、输血后紫癜、难治性血小板减少。流式细胞可快速准确地检测血小板自身抗体。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别血小板抗体。　　7、移植交叉配型　　原细胞毒实验，主要用于避免移植物超急性排拆反应。流式细胞仪用于监测T或B细胞是否受到受体血清中免疫球蛋白攻击，作为HLA配型前的预实验。流式细胞仪因其高**性已成为该领域内的金标准。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别T细胞CD3或B细胞CD29抗体。　　8、检测细胞经抗原或细胞有丝分裂刺激后活化效应淋巴细胞早期活化指标CD69可用来检测免疫**效果。流式细胞使用三色分析可监测淋巴细胞各亚群活化情况：FITC标记的CD3抗体、PE标记的CD8抗体、PE-CY5标记的CD69抗体。　　9、细胞增殖状态检测　　核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量细胞增殖分裂状况，在评估肿瘤预后有重要意义。为些标志物的检测一般同细胞表面标志物同时检测。FITC标记PCNA或Ki67或BrdUrd，PE或（并）PE-CY5标记细胞表面标志物。　　10、染色体分析　　流式细胞仪染色分析运用两种特异性染料：Hoechest33258与核苷酸AT结合；Chromomycin A3与GC相结合。从而在双参数坐标上根据染色体ATCG含量的不同识别各种染色体。平时进行的染色体分析耗时且需要操作者**经验，而用流式细胞仪时可快速地识别出异常染色体，如加配分选系统可将这些异常染色体分选出来作进一步分析。