Waters2695液相色谱仪HPLC使用方法 液相色谱使用方法

　　[目的]　　规范Waters液相色谱系统的使用和维护。　　[范围]　　本规程适用于Waters液相色谱系统的使用和维护。　　[职责]　　质检室仪器分析员负责Waters液相色谱系统的日常使用和维护。　　[系统组成]　　本系统由Waters 600E多溶剂输送系统(有梯度控制器的高压输液泵)、Waters在线脱气机、Rheodyne 7725i手动进样阀、Waters 2487双通道紫外检测器、Millennium32色谱工作站/电脑等组成，另外还包括打印机、断电保护器和通风柜等辅助设备。　　[开机程序]　　1. 状态检查：　　1)检查仪器外观是否完好　　2)检查各种线缆连接是否稳固，外表有无损伤痕迹　　3)确认环境温度在15至35℃之间　　4)相对湿度在20%至80%之间　　3. 接线要求：　　1)液相色谱主机电源　　2)连接电脑主机和显示器电源　　4. 开机步骤：　　1)打开电脑电源，进入windows系统　　2)打开液相色谱电源，仪器开始自检(约5～6min)，待仪器操作面板上出现“Idle”字样表示自检成功，仪器进入待命状态。　　[测试步骤]　　1. 进入软件　　1)双击电脑桌面上的Empower快捷图标，出现Empower登陆窗口。输入用户名与密码，默认账号为“system”，密码为“manager”，点击“OK”进入Empower工作站。　　2)选择“运行样品”界面，点击“确定”,然后选择待选定的操作项目以及色谱系统　　2 编辑仪器方法和方法组　　1)在“运行样品”界面中，监视区单击方法组编辑向导。　　2)选择新建按钮，弹出仪器方法编辑器。　　3)通用编辑页面中，可设置单次输送体积，查看脱气选项，确认设置正确，选择等度或者梯度，总流量以及流动相配比等选项。　　4)单击2475图标，弹出2475编辑界面，在波长模式中选择相应的波长模式，单波长或者双波长，输入所需的波长，选择相应的采样速率，一般为2点/秒。　　5)点击“文件”，选择“另存为”，输入仪器方法名称，点击“保存”，退出。　　6)在被选项中选择所需的仪器方法名称，点击“下一步”。　　7)在下拉菜单中选择所需的处理方法和报告方法(如果没有合适的方法选择"无处理"、"无报告")，点击“下一步”。　　8)输入方法组名称，单击"完成"。　　3 运行方法进样　　1)在“运行样品”界面中，选择相应的仪器方法，点击“监视器”，在监视窗口监视基线至系统平衡，停止系统监视状态，点击停止按钮。单进样，点击参数编辑快捷方式进入定义单进样参数编辑界面，输入样品名、功能、方法组等参数。点击“进样”。　　2)建立样品组和样品组方法　　选择“样品组”任务栏，进入样品列表，依次设置以下内容：样品瓶号、样品名称、样品类型、进样次数、进样体积、运行时间、方法组、、下一进样延迟时间等，点击“运行”，方法组开始进样。　　[更换溶剂]　　1.打开600E泵后，转动进口集合管阀手柄(以下简称手柄)至RUN位置；　　2 .将一塑料烧杯放在参照阀出口管下以收集分流的溶剂，向右打开参照阀(断开柱和进样器)；　　3. 按[Direct]键使其显示直接控制屏幕，设流速为1ml/min(梯度配比阀在0ml/min时不工作)；　　4. 选择欲使用的某一溶剂通道，设其比例为**，其它为0%；　　5. 将输液管从原有溶剂瓶中取出，放入一干净的空瓶中；　　6. 逆时钟转动手柄至DRAW位置，用启动注射器从进口集合管阀的接口抽出约2ml溶剂；　　7. 再将输液管放入新溶剂瓶内，继续抽吸直到新溶剂出来并无气泡为止；　　8. 转动手柄至RUN位置，将启动注射器取下并排掉筒内的溶剂。　　9. 重复5.2.2.4.~5.2.2.8.直至所有即将使用的溶剂更换完毕。　　[排气泡]　　1. 打开参照阀，换流动相为**超纯水，设流速为10ml/min(注意：确认参照阀是打开的，否则可能损坏安装好的柱)；　　2. 转动进口集合管阀手柄至DRAW位置，用启动注射器抽出约10ml水；　　3. 顺时钟转动手柄至INJ位置，缓慢用力使水通过泵头从参照阀出口管排出(注意不要将气泡注入泵中)；　　4. 按[Stop flow]屏幕键停泵，关上参照阀。　　5. 如按以上方法不能排尽气泡，从柱入口处拆下泵出口管，用塑料管连接至塑料烧杯中，设流速为10ml/min，冲洗2~5min(或更长时间)后停泵，重新接上柱。　　[平衡系统（分两种情况进行）]　　1. 等度模式　　1.1. 每次以0.1ml/min的增量加大流速至1ml/min，以超纯水冲洗系统10min。　　1.2. 检查管路连接、柱接口及泵头处是否漏液，如漏液应予以排除。　　1.3. 观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应在平均值的5~10%以内。如超出此范围，可初步判断为柱前管路仍有气泡，重复5.2.3.下的步骤。　　1.4. 压力波动平稳后，换检验方法规定的流动相比例冲洗系统。在检查基线稳定性前，让zui少5~6倍柱体积的流动相通过系统。　　1.5. 在QuickSet窗口下的Instrument Method档内选择所需的仪器方法，按「Monitor」(此后泵由软件控制)，观察基线和压力变化。如果冲洗至基线漂 移<10-3Au/min，噪声为10-4Au数量级，且压力平稳时，可认为系统已达到平衡状态，可以进样。5.3.1.6. 按「Abort」图标(左上第五个)，停止监视基线。　　2. 梯度模式　　2.1. 按检验方法规定的条件冲洗平衡系统，并注意压力波动变化和排气泡。　　2.2. 在进样前运行1~2次空白梯度。　　[进样]　　1. 在QuickSet窗口内左下部选〈Single〉标签，在Sample Name档内填写试样名称；在Function档内选择试样类型(标准选“Inject Standards”；样品选“Inject Samples”)；在Method Set档内选择所需的方法组；在Injection Volume档内输入进样体积；在Run Time档内输入记录时间。　　2. 用针头滤器过滤试样溶液(注射液可不必过滤)，用试样溶液清洗注射器，并排除气泡后抽取适量。如按部分装液法，用微量注射器定容进样时，进样量应不大于定量环体积的50%，并要求每次进样体积准确、相同；5.4.2.2. 如按**装液法，用定量环定容进样时，进样量应不小于定量环体积的3倍(5~10倍准确性更佳)。　　3. 按〈Single〉标签内右边的进样(Inject)按钮，等待窗口底部状态档内显示“Waiting”后，方可进样。　　4. 将进样阀手柄转动至Load位置，将注射器针**插入进样阀入口中，平稳地注入试样溶液，除另有规定外，让注射器留在进样阀上，将进样阀手柄快速转动至Inject位置，系统将自动运行，采集数据并记录图谱。　　5. 让进样阀手柄保持在Inject位置，到下次进样前1~2min切换回Load位置，将注射器从进样阀中拔出。　　6. 先用水再用试样溶液清洗注射器后，按以上程序继续进样，直至完成。　　[数据处理（外标法）和打印]　　1. 右击系统主界面下的『Browse Project』图标，选择相应的项目，按「OK」进入Project窗口，选〈Channels〉标签。　　2. 建立处理方法　选择一个待积分的标准，右击后选“Review”进入Review窗口。按「Processing Method Wizard」图标(左边*个)进入New Processing Method向导窗口，按「OK」。　　2.1. 划入一个感兴趣的zui窄的峰，按「Next>」；　　2.2. 划入一段包含噪声的基线，按「Next>」；　　2.3. 划入一段要积分的区间，按「Next>」；　　2.4. 根据情况选择zui小峰面积和zui小峰高，按「Next>」、「Next>」；　　2.5. 在Name档内输入各组分峰的名称，按「Next>」、「Next>」；　　2.6. 在Method Name档内填写方法名称，按「Finish」。退出Review窗口。　　3. 修改标准　选中所有标准，右击后选“Alter Sample”进入Alter Sample窗口。　　3.1. 在Sample Type档内将Unknown改成Standard；　　3.2. 按「Amount」图标(左上第六个)进入Component Editor窗口；　　3.3. 按「Copy from Process Method」图标(左上第五个)，选择刚建立的处理方法，按「Open」，在Value和Units档内分别输入标准所含各组分的数值和单位，完成后按「OK」回到Alter Sample窗口；　　3.4. 按「Save」图标存盘，退出Alter Sample窗口。　　4. 积分　先选中所有标准，再选中所有未知样品，右击后选“Process”进入Background Processing & Reporting窗口，选Use specified processing methods，在右边档内选择刚建立的处理方法，按「OK」。　　5. 打印　在Project窗口下选〈Results〉标签。　　5.1. 选中要打印的标准/样品，右击后选“Preview”进入Open Report Method窗口，选合适的打印方法，按「OK」进入Report Publisher (Preview)窗口，预览打印的结果。按打印(Print)图标(左上第二个)即可打印结果。　　5.2. 按「Close」可进入Report Publisher窗口对报告方法进行修改，完成后按「Print」图标(右数第二个)即可打印结果。　　6. 数据处理完成后，关闭所有窗口，在主界面下按「Logout」退出系统，关闭Millennium32软件，再依次关闭电脑主机、显示器、打印机。　　7. 清洗系统和关机　　7.1. 数据采集完毕后，关闭检测器，继续以工作流动相冲洗10min后，换水冲洗。　　[关机程序]　　1)关机前应用适当比例的有机相和水相冲洗柱子　　2)关闭仪器电源　　3)关闭电脑电源　　[维护保养程序]　　1)定期清洁，保障环境和仪器室内卫生条件，防尘。　　2)使用完毕后用防尘布遮盖仪器如连续3个月未使用仪器，将仪器通电1个小时后再关闭，除掉仪器内部湿气。　　［注意事项］　　1.使用仪器前必须仔细阅读仪器使用说明书。　　2.按仪器使用要求准备测试样品，不得测试不符合要求的样品。　　3.小心操作，防止样品污染和腐蚀仪器。　　4.有机溶剂有害健康，各溶剂瓶口应封严。　　5.仪器使用后按操作程序，切断电源，清理擦拭仪器，盖上仪器罩。　　6.在操作时发生故障应停止使用，并及时通知管理人员。 液相色谱柱柱压升高的原因

　　造成柱压升高的原因很多。一般是由于柱床内产生了异常的占位性物体，造成流体阻力加大所引起的。

　　1、流动相过滤不良

　　因机械性杂质堵塞进口滤片，导致压力升高。这往往是由于流动相没有过滤，或虽已过滤但滤膜孔径过大或滤片损坏，使固体杂质滞留于滤板上所造成的。湿度传感器探头,不锈钢电热管PT100传感器,铸铝加热器,加热圈流体电磁阀

　　2、霉菌生长

　　霉菌在流动相中、管路中或柱子进口处繁殖、生长堵塞滤板，导致压力升高。这种现象在夏季，尤其是使用磷酸盐缓冲液为流动相时更易发生。在夏季使用磷酸盐缓冲液时一般要现配现用。即使保存在冰箱中，一般也不要超过两天。否则，即使不堵塞滤板，也会因**或霉菌孳生产生代谢物而造成对样品分析的干扰。

　　3、非特异性吸附

　　当溶质在柱子上有较强的非特异性吸附，且当前所用的流动相难以将它们洗脱时，累积的未洗脱溶质也会造成阻力增大和压力升高。

　　4、更换流动相时置换不**

　　当改换流动相体系时，不**的更换使不同性质、互不混溶的流动相存在于一个体系之中，也会造成压力升高。

　　5、盐晶体的析出

　　使用缓冲液或添加有缓冲液的流动相后，缓冲液中的无机盐成份可能会残留在体系之中。它们会因在新流动相体系中的溶解度降低而析出，造成流体阻力加大、压力升高。

　　6、样品的沉淀

　　当样品所使用的溶剂与流动相不一致时，样品进入柱中有时可能因溶解度降低而沉淀出来，造成压力升高。

　　7、压力脉冲

　　运行过程中，有时会产生系统内压力的突然升降。例如，转动进样阀时动作过缓，造成液流堵塞后再瞬间释放;开机瞬间压差较高等。如此所形成的压力脉冲会造成多孔填料的崩坏和柱床结构的微小变化。填料微屑的长期积累也可能会使柱床阻力增大。