液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。正相柱大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合-CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱;反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。另外还有离子交换柱，GPC柱，聚合物填料柱等。下面介绍一下反相色谱柱的选择和使用：
一、反相色谱柱的选择
1.柱子的PH值使用范围
反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。但硅胶为基质的填料，使用时**要注意流动相的PH范围。一般的C18柱PH值范围都在2-8，流动相的PH值小于2时，会导致键合相的水解;当PH值大于7时硅胶易溶解;经常使用缓冲液固定相要降解。一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。如果流动相PH较高或经常使用缓冲液时，建议选择PH范围大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH2-9或Zorbax的PH2-11.5的柱子。
2.填料的端基封尾（或称封口）
把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾;含碳量**了，有利于不易保留化合物的分离;填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，***好选用填料经端基封尾的色谱柱。
二、液相色谱柱的使用
色谱柱在使用前，***好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行（出厂测试所使用的条件是***佳条件），只有这样，测得的结果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同。
1、样品的前处理
a、***好使用流动相溶解样品。
b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。
2、流动相的配制
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：
a、流动相对样品具有**的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中（或长时间保留在柱中）。
b、流动相与样品不产生化学反应c、流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果;降低柱压降，延长泵的使用寿命（可运用提高温度的方法降低流动相的黏度）。
d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，***好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后，**要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
3、流动相流速的选择
因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求***佳柱效，***好使用***佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml/min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml/min为佳。
当选用***佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间（如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量）。
注意：
a.含水流动相***好在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。***好加入叠氮化钠，防止**生长。
b.流动相要求使用0.45μm滤膜过滤，除去微粒杂质。
c.使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。
三.色谱柱的维护
1.色谱柱的平衡
反相色谱柱由工厂测试后是保存在乙腈/水中的。新柱应先使用10-20倍柱体积的甲醇或乙腈冲洗色谱柱。请**确保您分析样品所使用的流动相和乙腈/水互溶。每天用足够的时间以流动相来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得**的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长!操作步骤：
a.平衡开始时将流速缓慢地提高，用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂流速如果较低，则需要较长的时间来平衡）
b.如果使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"即每天分析开始前必须先用纯水冲洗30分钟以上再用缓冲盐流动相平衡;分析结束后必须先用纯水冲洗30分钟以上除去缓冲盐之后再用甲醇冲洗30分钟保护柱子。
2.色谱柱的再生
长期使用的色谱柱，往往柱效会下降（柱子的理论塔板数减低）。可以对色谱柱进行再生，在有条件的实验室应使用一个廉价的泵进行柱子的再生。
建议用来冲洗柱子的溶剂体积
色谱柱尺寸柱体积所用溶剂的体积
125-4mm1.6ml30ml
250-4mm3.2ml60ml
250-10mm20ml400ml
选择再生方法：
极性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色谱填料）的再生：
正庚烷→→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**
非极性固定相（如反相色谱填料RP-18，RP-8，CN等）的再生：水→乙腈→（或异丙醇）→乙腈→水
注意：
a.在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能以铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液**流出稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱，如果简单的用有机溶剂/水的处理不能够**洗去硅胶表面吸附的杂质，在水洗后加用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。
3.色谱柱的维护
a.使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有**的溶解度）
b.大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2-7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围
c.避免流动相组成及极性的剧烈变化
d.流动相使用前必须经脱气和过滤处理
e.如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存于甲醇或乙腈中
f.氯化物的溶剂对其有**的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀
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【***** 使用手册】气相色谱操作条件的选择，常常决定是否能够达到分离的目的，而选择试验条件的主要依据是范氏方程和分离度与各种色谱参数的关系式。气相色谱柱分析条件的选择主要包括柱温、载气种类和流速等的选择。适当的分析条件，可以在较短的时间内完成分析工作，并达到良好的定性定量目的。在日常工作中，如何进行色谱柱分析条件的选择呢？ 柱温的选择 柱温是影响分析时间和分离度的重要因素。选择柱温的依据是样品的沸点范围，固定液的配比，允许使用温度，以及检测器的灵敏度。 柱温主要影响分配系数、容量因子以及组分在流动相和固定相中的扩散系数，从而影响分离度和分析时间。选择温柱的原则，一般是在使难分离物质对达到要求的分离度条件下，尽可能采用低温柱，其优点是可以增加固定相的选择性，降低组分在流动相中的纵向扩散，提高柱效，减少固定液的流失、延长柱寿命和降低检测器的本底。 提高柱温可以使保留时间减少，加快分析速度，使样品中组分**流出，但是分离效果不好。降低柱温，样品有较大的分配系数，选择性高，有利于分离。但温度过低，容易引起峰形拖尾或前伸，并且分析时间长。可根据固定液的使用温度极限和样品组分沸点调节柱温。 对于高沸点混合物，在保证分离**的前提下，尽量降低柱温。可在低于分析物沸点180℃～200℃的柱温下进行分析；对沸点不太高(200～300℃)的样品，柱温可选100℃以下；对于气体、气态烃等低沸点混合物，一般选择室温或50℃以下进行分析。对于宽沸程样品，需采用程序升温法进行分离，即柱温按预先设定的程序随时间成线性或非线性增加，从而获得分离效果。 载气的选择 一般说来，痕量分析或毛细管色谱的载气纯化程度，要高于常规分析。特别是电子捕获、热导池检测器，载气纯度直接影响灵敏度和稳定性，**要严格净化。 根据分析对象，对于色谱柱的类型，操作仪器的档次和具体检测器，若使用不合要求的低纯度气体，不良影响有以下几种可能： a.样品失真或消失：如H2O气使氯硅样品水解； b.色谱柱失效：H2O，CO2使分子筛柱失去活性，H2O气使聚脂类固定液分解，O2使PEG固定液断链； c.有时某些气体杂质和固定液相互作用而产生假峰； d.对柱保留特性的影响：如H2O对聚乙二醇等亲水性固定液的保留指数会有所增加，载气中氧含量过高时，无论是极性或是非极性固定液柱的保留特性，都会产生变化，使用时间越长影响越大； e.检测器：TCD：信噪比减小，无法调零，线性变窄，文献中的校正因子不能使用，氧含量过大，使元件在高温时加速老化，减少寿命；FID：特别是在Dt≤1×10-11/S下操作时，CH4等有机杂质会使基流激增，噪声加大不能进行微量分析； f.在做程序升温操作时，载气中的某些杂质，在低温时保留在色谱柱中，当柱温升高时不但引起基线漂移，还可能在谱图上出现比较宽的“假峰”； g.仪器影响：各类过滤器加速失效；调节阀(稳压阀，稳流阀，针形阀) 被污染，气阻堵塞，调节精度降低或失灵；气路系统被污染，若要恢复仪器在高灵敏度情况下操作，有时要吹洗很长时间(可能一周以上), 污染严重时有时再也无法恢复；对于FID，水蒸气会影响分析结果，直至影响检测器的寿命；对ECD和TCD的寿命明显，这点应引起用户特别注意。 载气的压力和流速 载气压力对柱效率有直接的影响。如提高柱内压力，有助于提高柱效率。但只提高入口压力，使流速加大且压降太大时，反而会降低柱效率，因此也必须提高出口压力。一般采用在柱后加装适当气阻的方法来解决这一问题。 载气流速主要影响分离效率和分析时间。为获得高柱效，应选用佳流速，但所需分析时间较长。为缩短分析时间，一般选择载气速度要高于佳流速，此时柱效虽稍有下降，却节省了很多分析的时间。常用的载气速度流速为20～80mL/min。 对于FID 或FPD 检测器，氢气和空气的比例是影响分离度和灵敏度的重要因素，只有反复试验，才能确定适合的比例。对于填充柱色谱柱，载气流入方向要尽量与色谱柱内固定相装填方向一致，以减小压差，提率。 进样量的选择 进样量的多少直接影响谱带的初始宽度。因此，只要检测器的灵敏度足够高，进样量越少，越有利于得到良好的分离。一般情况下，柱越长，管径越粗，组分的容量因子越大，则允许的进样量越多。一般气体进样量在1～10mL，液体进样量在0.5～10μL 之间，可取得较好的分析效果。此外，进样速度要快，进样时间要短，以减少纵向扩散，有利于提高柱效。 气化温度的选择 气化温度取决于样品的挥发性、沸点范围及进样量等因素。气化温度选择不当，会使柱效下降。通常气化室的温度选择为样品沸点或高于沸点，以保证样品能瞬间气化；但不要超过沸点50℃以上，以防止样品分解。 对于一般的气相色谱分析，气化温度比柱温高10～50℃即可。但对于某些高沸点组分或热稳定性差的组分，在其沸点左右分析会产生分解现象。此时应采取的措施是减少进样量，采用高灵敏度检测器，气化室温度的选择应低于其沸点100～200℃。 从以上介绍的选择原则可以看出，各种条件往往同时影响色谱柱的选择性和效率，它们之间既密切联系又互相制约。因此在实际分析中，要作综合考虑，灵活地运用这些原则，既要保证良好的选择性，又要保证分离效率，合理地选择佳色谱分析条件。
当色谱柱使用一段时间以后，柱内由于各种原因，滞留了一些高沸点组分或氧化物等，除柱效有所下降外，还可能出现基线波动或“鬼峰”。为了去除污染物，使柱效和基线恢复到原来的状态，称为色谱柱的再生。色谱柱的再生和柱老化有**区别和不同，它是柱在使用一段时间柱性能下降，经处理后尽量恢复到原来性能的过程。A、色谱柱在以下几种情况必须再生处理a.使一段时间，柱效明显下降；b.柱被污染，特别是在程序升温时，基线漂移和噪声超过容忍程度或出现“鬼峰”；c.柱头塌陷，柱床短路或断位(在玻璃柱中容易发现)，而出现尖峰或双重峰；d.峰形展宽，保留时间明显变化；e.待分离组分和固定相表面非特异性相互作用，引起保留时间较短的峰拖尾或出现双峰；B、毛细管柱再生的几种方法a.用载气将色谱柱污染物冲洗出来；b.将柱头截去100mm 或更长一些；c.若使用交联的色谱柱，可在仪器上反复注射溶剂进行冲洗。常用的溶剂依次为丙酮、甲苯、乙醇、氯仿和二氯甲烷，每次可进样5～10μL；d.交联柱在仪器上冲洗无效时，可把柱拆下来用二氯甲烷或氯仿冲洗，溶剂用量视柱的污染程度而定，一般20mL 左右。C、色谱柱再生前应注意的问题当分析出现问题时，不能只考虑是柱问题，而马上进行再生。除上述情况外，还应考虑样品处理、进样技术、操作有无失误、数据处理参数有无改变等可能带来的问题。a.衬管、预柱和检测器被污染也会引起基线不稳定、出现“鬼峰”或裂解峰；b.新的注射垫也会引起基线漂移和出现“鬼峰”；c.衬管密封欠佳、柱安装死体积或检测器固有特性也会引起较早出现峰的拖尾；d.分析系统发生变化(如漏气严重)也可能使保留时间突变；e.峰变宽，除柱效下降外也可能由柱外效应引起；f.进样量太大也会引起峰变宽、拖尾或保留时间变短；g.色谱柱长时间样品过载，保留时间也会变小等。D、色谱柱再生时应注意的几个问题1.如前所述和色谱柱老化一样，不是温度越高越好，时间越长越好；建议不要使用长时间烘烤的方法，来处理受到污染的色谱柱，因为烘烤时，温度会把污染的残留物变成不能溶解的物质，再用溶剂清洗也无济于事；2.仪器在高灵敏度操作时，如：量程在1×10-11A/mV以下，痕量分析程序升温过程中，温度升到大于180℃后，基线明显漂移是不可避免的；3.不同类型柱子，再生方法不同；4.样品种类、组分、进样量不同或操作时间长短不同，再生方法也不同；5.仪器本身条件如：气源种类、纯度、净化条件、进样口结构和操作检测器不同，再生柱方法也有区别；6.高分子量组分污染色谱柱后，高温再生时间长会导致固定相的老化；使用交联或键合柱***好用溶剂漂洗再生，漂洗溶剂流动方向**要从柱出口注入。应该注意，毛细管柱交联键合率通常不到90%，因此会漂洗掉未化学结合的液相部分，所以保留时间和分离状态会有所变化；7.对于难挥发物，碳化物是不能通过再生除去，对于填充柱***好使用带衬管气化室进样器，对于毛细管可通过把柱入口切去30～50cm的方法除去污物段。有条件的可以使用预柱，把不挥发的有机物、无机物和颗粒材料阻留在预柱中，需要时更换预柱；8.在某些情况下，色谱柱要在温度极限附近使用，这时基线漂移和大噪声已不可避免，柱的再生要求只能视情况而定；9.不是所有色谱柱通过再生均能恢复原来性能。
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