液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决；而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。A、峰拖尾原 因 解决方法1、筛板阻塞 a、反冲色谱柱 b、更换进口筛板 c、更换色谱柱2、色谱柱塌陷 填充色谱柱3、干扰峰 a、使用更长的色谱柱 b、改变流动相或更换色谱柱4、流动相PH选择错误 调整PH值。对于碱性化合物，低PH值更有利于得到对称峰5、样品与填料表面的溶化点发生反应 a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂b、更改色谱柱 B、峰前延原 因 解决方法1、柱温低 升高柱温2、样品溶剂选择不恰当 使用流动相作为样品溶剂3、样品过载 降低样品含量4、色谱柱损坏 见A1、A2C、峰分叉原 因 解决方法1、保护柱或分析柱污染取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞，拆下来清洗。如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施。如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。2、样品溶剂不溶于流动相 改变样品溶剂。如果可能采取流动相作为样品溶剂。D、峰变形原 因 解决方法1、样品过载 减少样品载量E、早出的峰变形原 因 解决方法1、样品溶剂选择不恰当 a、减少进样体积 b、运用低极性样品溶剂F、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰原 因 解决方法1、柱外效应 a、调整系统连接（使用更短、内径更小的管路） b、使用小体积的流通池G、K’增加时，脱尾更严重原 因 解决方法1、二级保留效应，反相模式a、加入三乙胺（或碱性样品） b、加入乙酸（或酸性样品） c、加入盐或缓冲剂（或离子化样品） d、更换一支柱子 2、二级保留效应，正相模式a、加入三乙胺（或碱性样品） b、加入乙酸（或酸性样品） c、加入水（或多官能团化合物） d、试用另一种方法3、二级保留效应，离子对 加入三乙胺（或碱性样品）H、酸性或碱性化合物的峰拖尾原 因 解决方法1、缓冲不合适 a、使用浓度50-100mM的缓冲液 b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液I、额外的峰原 因 解决方法1、样品中有其他组份 正常2、前一次进样的洗脱峰 a、增加运行时间或梯度斜率 b、提高流速3、空位或鬼峰 a、检查流动相是否纯净 b、使用流动相作为样品溶剂 c、减少进样体积J、保留时间波动原 因 解决方法1、温控不当调好柱温2、流动相组分变化防止变化（蒸发、反应等）
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每天用足够的时间来维护色谱柱，您将节省更多用于处理色谱柱故障的时间，同时您的色谱柱的寿命也会变得更长！色谱柱的使用寿命，除了与所分析的样品和流动相及使用频率有关外，主要的是与日常的维护密切相关。色谱柱的使用寿命主要是根据柱效和柱压两个指标来衡量，如果一支色谱柱柱效太低或柱压太高，通常被认为该色谱柱的使用寿命已经结束。因此，延长色谱柱使用寿命的关键是，**引起柱效下降和柱压升高的因素。通过以下几点帮助您完成色谱柱的日常维护工作。
流动相的pH 值
由于硅胶基质的填料中存在Si-C和Si-O键，流动相超过其pH范围将会导致硅胶基质溶解和键合相碳链断裂，使柱效下降，寿命变短。由于流动相的pH控制不当而对色谱柱造成的损害，通常很难使色谱柱恢复，因此必须认真对待，严格控制流动相的pH值。。
去除样品和流动相中的固体颗粒
样品和流动相中含有的固体颗粒物质会堵塞色谱柱筛板，筛板被堵不仅会引起柱压升高，而且也会引起柱效下降，因为筛板的堵塞会引起液流不均，导致色谱峰形拖尾、变宽，甚至出现双峰，从而使柱效下降。因此，建议使用超纯水和色谱纯试剂，在分析前对样品进行超声、针筒过滤，流动相过0.45µm 滤膜，尤其是流动相加入了缓冲盐（如NaH2PO4等），必须过滤。
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使用保护柱或在线过滤器
样品和流动相经过滤后并不能****固体颗粒物质，因为泵的磨损、密封圈和管路的老化也会产生固体颗粒物，这些固体颗粒被流动相带入色谱柱，堵塞筛板，导致柱压升高、柱效下降。保护柱和在线过滤器上都有筛板，其孔径与色谱柱筛板孔径相同，因此可以阻止固体颗粒物质到达色谱柱，有效防止色谱柱筛板的堵塞。由于柱压升高在分析故障中占很大比例，因此，除对样品和流动相进行过滤外，建议您在色谱柱进样端加上保护柱或在线过滤器。
正确使用缓冲盐
缓冲液可以提供离子平衡的反离子，并使流动相保持**的离子强度和p H 值，减少拖尾。缓冲盐通常易溶于水，难溶于有机溶剂，因此缓冲盐使用不当会致其析出，堵塞填料基质上的微孔和颗粒间的空隙，使填料板结，柱压上升；同时阻碍了基质上键合的碳链自由舒展，使色谱柱的保留能力下降，柱效降低。缓冲盐析出后，去除非常困难，因此，正确的使用缓冲盐对延长色谱柱使用寿命非常重要。
正确使用缓冲盐的目的是防止缓冲盐析出，因此正确使用缓冲盐的方法可归结为一句话：使用前要过渡，使用后要冲洗。
具体方法如下：
a . 等度条件：使用缓冲盐前用过渡流动相以1.0mL/min 流速冲洗20-30倍柱体积，然后再使用含有缓冲盐的流动相；使用后去除缓冲盐的方法是用过度流动相以1.0mL/min流速冲洗30倍柱体积，然后以纯有机溶液冲洗30倍柱体积保存。
b .梯度条件：用含有缓冲盐的流动相进行梯度洗脱之前，用与初始流动相组成相同的过渡流动相以1.0mL/min流速冲洗30倍柱体积，再开始梯度的运行；分析完成后，再用过渡流动相以1.0mL/min冲洗色谱柱30倍柱体积，然后以纯有机溶液冲洗30倍柱体积保存。
另外，在使用缓冲液的过程中还要注意以下几点：
a .避免使用盐酸盐，盐酸盐对钢质有腐蚀作用；
b .缓冲液需现配现用，往往缓冲液是良好的菌类培养液，隔天或放置长时间实验时会发生很多怪现象；
c .使用缓冲液要及时掌握pH范围，做到胸中有数；
d .清洗液路和柱子时，有温控可加热到30摄氏度易于冲洗；
e.长时间用缓冲溶液要注意观察接头处有无析出，若有白色盐类析出，定期用10%硝酸冲洗液路（拆下柱子，冲洗30mL10%硝酸溶液，再用5倍水冲洗）可以避免液路的堵塞；
f.选择缓冲液要用可靠的试剂，避免不纯的盐类造成不必要的麻烦；
过渡流动相是指有机相和水相的组成与分析流动相相同，但是不含缓冲盐的溶液。
防止强保留物质在色谱柱中存留
强保留物质和大分子化合物在色谱柱中累积，对样品中的化合物产生额外的保留行为，不仅引起峰形变宽、拖尾，使柱效下降，同时也会引起保留时间的变化，累积到**程度时还会导致柱压升高。由于强保留物质和大分子化合物对色谱分离的影响是一个累积效应，需要**的时间才会体现出来，但对许多样品特别是复杂样品而言，很难判断其是否含有强保留物质，因此要防止强保留物质的累积，需要在每天的日常维护中用纯甲醇或乙腈30倍柱体积清洗色谱柱。
色谱柱的再生
a、反相柱
以下列溶剂顺序冲洗30倍柱体积
乙腈－水（5:95） → THF → 乙腈－水（5:95）
b、正相柱
以下列溶剂顺序冲洗30倍柱体积
正己烷 → 二氯甲烷 → 异丙醇 → 二氯甲烷 → 流动相
c、硅胶柱（Si）除水
30mL 2.5% 2,2 二甲氧基丙烷和2.5%冰醋酸正己烷溶液冲洗柱子
**液相色谱(HPLC)作为一种分离技术和方法，目前已经发展到一个全新的阶段。高精度的输液泵，应用广泛的色谱分离柱，低噪音、高灵敏度的各种检测器和功能强大的数据处理软件系统的出现，都推动了液相色谱技术的迅猛发展。液相色谱仪正以它分辨率高、分析速度快和应用广泛的优点倍受仪器分析工作者的青睐，广泛地应用于医药卫生、环境监测、食品检测等领域。
1、**液相色谱仪的基本工作试验方法
**液相色谱仪如图1所示，是由溶液贮器、高压泵、进样系统、色谱分离柱、检测器和数据处理系统几部分组成。
高压泵从溶液贮器中抽走流动相，流经整个仪器系统，形成密闭的液体流路。样品通过进样系统注入色谱分离柱，在柱内进行分离。柱流出液进入检测器，使已被分离的组分逐一被检测器收集，并将响应值转变为电信号后经放大被数据处理系统记录色谱峰，通过数据处理系统对记录的峰值进行存储和计算[1]。
液相色谱仪是依靠色谱柱进行分离的。研究证明：物质的色谱过程是指物质分子在相对运动的两相(液相和固相)中分配“平衡”的过程。液相色谱是以具有吸附性质的硅胶颗粒为固定相，各种洗脱液为流动相。当液体样品在载体流动相的推动下，在液-固两相间作相对运动时，由于各组分在两相中的分配系数(K)不同，则使各自的移动速度不同，即产生差速迁移。各组分在两相间经过多次分配，从而达到使混合物分离的目的。
2、输液泵的常见故障及对策：
输液泵/高压泵是保证HPLC系统流路畅通、流量**和压力稳定的重要仪器部件，目前多用往复式恒流柱塞泵，主要由柱塞杆、密封垫圈和两个单向阀组成，用马达带动凸轮驱动柱塞杆作吸液和排液的往复运动。常分为单柱塞泵、并联柱塞泵、串联柱塞泵和柱塞隔膜泵等类型。流动相混合方式分为低压混合和高压混合。常见泵的故障主要有以下几种，并提供解决的办法。
2.1单向阀故障 由于球与阀座密封不严，液体倒流，造成压力不稳，甚至球与阀座粘在一起阻死。密封不严主要是污染或气泡引起，球与阀座粘连也是由于污染和磨损造成。
为避免单向阀中的宝石球和阀座被污染，流动相应使用HPLC级的溶剂，并且配好的流动相**要用0.45u滤膜过滤和脱气。如果泵被微粒污染，可分别用水、甲醇、异丙醇、二氯甲烷依次冲洗。冲洗时应打开泄液阀，***后再用所用的溶液冲洗整个系统。
气泡进入阀中会紧贴在阀体的一侧，使宝石球难返回到阀座，引起倒流，泵的压力和流速会明显改变。此时，应立即打开泄液阀，大流量(2ml/min)冲洗泵，直至排除液为直线型。因为甲醇可润湿泵内壁，挤出气泡，故也可使用脱过气的甲醇冲洗泵。长期不用的泵或新装的泵头应该用甲醇赶气泡。泵进气泡也可在泵头上排气泡，即用扳手固定住进气泡的泵头，拧开输出管道的压帽，手动泵送液，可见到气泡从孔中挤压出来，直至无气泡排出将压帽拧紧。
采取上述办法仍不能使压力稳定，应考虑是否密封垫坏了？或单向阀磨损、球不光滑等，需更换部件。
2.2泵垫圈故障泵垫圈常见的故障是渗漏和垫圈受损污染系统。液相色谱系统一般情况下不要使用强酸强碱溶液，因为这会损坏密封垫和柱塞杆。密封垫圈与运动着的柱塞杆紧密接触，可使柱塞在泵头自由运动而流动相不漏出来，它是液相色谱系统中***易磨损的部件。有条件的实验室可三个月更换一次垫圈，防止泵系统污染。如果用缓冲盐作流动相则更会加速垫圈的磨损，应及时冲洗。当垫圈损坏时，表现为：泵压力不稳、泵头漏液。一旦出现这个现象，应尽快更换新垫圈。
为避免上述故障的发生，我们在分析工作中应注意以下几点：
① 使用超纯水(18MΩ.cm)、纯度级别较高的试剂和色谱级溶剂配制流动相；
② 配好的流动相**要抽滤脱气，即便仪器有在线脱气装置，也***好在上机前进行抽滤。真空抽滤既过滤颗粒也脱了气泡，非常有效。
③ 泵在起动前**要通过泄液阀抽净泵里的空气。
④ 用缓冲盐洗脱时，分析结束后**要用水冲洗泵和整个流路系统，不要让腐蚀性溶液滞留泵中，***后用有机溶剂充满系统。
3、色谱分离柱的使用与维护
在前述仪器工作试验方法部分，我们已经指出，液相色谱仪的分离是在色谱分离柱中实现的。我们目前工作中多采用反相色谱柱，如何保护好分离柱减少柱的污染是延长柱寿命的关键。
3.1怎样维护好色谱分离柱
加保护柱(预柱)是保护分离柱的有效办法。保护柱是根内装填料与分离柱性质相近的短柱，接在分离柱之前，或代替流路过滤器。保护柱的作用是收集和阻塞分离柱口的化学垃圾，这些垃圾如果直接进入分离柱会逐渐堆积在柱头，***终降低柱效能。保护柱是消耗品，如分析血浆样品，一般分析50个样品后需更换新柱芯。
避免高压冲击分离柱。一般色谱柱都能承受得起高压，但经不住突然变化的高压冲击，这将改变柱床体积，影响柱效。引起高压冲击的原因主要有：进样器的样品阀的缓慢转动、泵启动太快、柱切换等操作。用手动进样阀时的压力变化不大，自动进样阀由于切换较慢，可能会造成压力冲击。
合理选择分离柱。我们知道，选择色谱分离柱主要根据两点，一是根据待测组分的分子量的大小；二是根据流动相条件，包括PH值、离子强度和溶剂极性等。传统硅胶基质的键合相柱要求流动相PH值在3-7之间，**PH值(>8)的流动相能溶解硅胶，使键合相流失。而目前利用先进的杂化颗粒技术研制的高纯硅胶颗粒填料(如Waters公司的XTerra色谱柱)，集硅胶和多孔聚合物填料的优点为一体，使有机硅烷单元取代了相当一部分占据颗粒内部和表面位置的硅羟基，使这种新型填料具有分辨率高、稳定性强、PH范围宽(1-12)的优势，其性能突破了传统**液相色谱柱的极限。所以**要根据分析的对象、流动相的条件选择合适的分离柱，茫然时可向公司的技术人员咨询。
定期冲洗分离柱。每次分析工作结束时，冲洗完缓冲盐后，***后要过度到用强溶剂冲洗柱子，如可用色谱纯甲醇、乙腈冲洗反相C18柱，目的是冲去吸附在柱上的强保留组分。如果用甲醇/水为流动相也应这样冲洗柱子，在**程度上可恢复柱效。
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