液相色谱仪使用注意事项及维护及解决方案

　　【***** 维修保养】液相色谱，是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。　　　　使用注意事项　　　　1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。　　　　2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。　　　　3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。　　　　4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。　　　　5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。　　　　6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。　　　　7.C18柱不能进蛋白样品，血样、生物样品。　　　　8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。清洗方法；①以异丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清洗；⑧用10％稀硝酸清洗。　　　　9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。　　　　10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。　　　　11.要注意柱子的pH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。　　　　12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。　　　　液相色谱仪的维护　　　　1．HPLC的日常操作条件：温度：10—30℃；相对湿度《80％；是恒温、恒湿，远离高电干扰、高振动设备。　　　　2．泵的保养：　　　　1)使用流动相尽量要清洁；　　　　2)进液处的沙芯过滤头要经常清洗；　　　　3)流动相交换时要防止沉淀；　　　　4)避免泵内堵塞或有气泡;　　　　3．进样器的保养：　　　　1)每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染；　　　　4．柱的保养：　　　　1)柱子在**情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；　　　　2)当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路**要清洗干净；　　　　3)要注意流动相的脱气；　　　　4)避免使用高粘度的溶剂作为流动相；　　　　5)进样样品要提纯；　　　　6)严格控制进样量；　　　　7)每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；　　　　8)每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；　　　　9)若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；　　　　5．检测器(UV)的保养：　　　　1)紫外灯的保养：在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器。　　　　2)样品池要保养。 有关液相色谱仪的系统组成介绍

液相色谱仪系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。

储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相；

被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数；

在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别；

被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪；

数据以图谱形式打印出来**液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统；

下面将分别叙述其各自的组成与特点。

进样系统

一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作，进样量是恒定的。

这对提高分析样品的重复性是有益的。

输液系统

该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。

高压泵的一般压强为47～44X10Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时；

可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度；

这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。

流动相贮存器和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变；

包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。

这就可使各种物质（即使**一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。

分离系统

该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。

色谱柱一般长度为10～50cm（需要两根连用时，可在二者之间加一连接管）；

内径为2～5mm，由"优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成；

住内装有直径为5～10μm粒度的固定相（由基质和固定液构成）。

固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成；

它们都有惰性（如硅胶表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔径可达1000?）和比表面积大的特点；

加之其表面经过机械涂渍（与气相色谱中固定相的制备一样）；

或者用化学法偶联各种基因（如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物。

因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。

例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。

另外，固定相基质粒小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。

基质粒度小，微孔浅，样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。

根据柱效理论分析，基质粒度小，塔板理论数N就越大。

这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。

再者，**液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C；

通过改善传质速度，缩短分析时间，就可增加层析柱的效率。