液相色谱在液相检验中的应用方法 液相色谱使用方法

液相色谱法是一种以液体为流动相的色谱法，液相色谱法是现在应用**广泛的一种液相色谱法，这种方法是20世纪60年代兴起的，经过不断的完善和发展，现已被应用于各个领域。在医药分析领域，液相检验的应用已经普及，而液相色谱法作为液相检验中的一种重要手段，也得到了大力的推广与应用，目前实验室常用的P230液相色谱仪。

　　液相色谱法及其系统构造

　　液相色谱法是以经典液相色谱法为基础，通过引入气相色谱理论而迅速发展起来的。区别于经典液相色谱法柱效低、时间长的特点，液相色谱法采用了高压泵、固定相和高灵敏度检测器等技术，因此其检测有高压、高速、、高灵敏度、检验速度快、分辨率高等特点，更适宜于分离、分析热稳定性差、高沸点、有生理活性及相对分子量比较大的物质。

　　HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、溶剂贮存器、检测器、检测数据记录器等组成。其中输液泵、色谱柱和检测器关键。制备型HPLC仪有馏分收集装置。新型HPLC仪增加了微机控制，可进行自动化仪器控制和数据处理。

　　输液泵性能的好坏直接影响分析结果的可靠性，好的输液泵应具备输出压力高，流量稳定、耐腐蚀，密封性能好，液缸容积小等特点；HPLC进样方式可分为：隔膜进样、阀进样、停流进样、自动进样，进样装置需要：密封性能好，重复性好，死体积小，对色谱系统的压力、流量影响小；色谱柱担负分离作用，是色谱系统的心脏，在选择色谱柱时要注意选择柱效高、选择性好，分析速度快的色谱柱；检测器是把洗脱液中组分的量转变为电信号，其要求线性范围宽、灵敏度高、重复性好、噪音低和适用范围广。

　　液相色谱的试验方法及分类

　　液相色谱的试验方法主要依靠分离机制，其分离方法有多种，相应的分离机制也不同。根据分离机制的不同主要有四种基本类型色谱法：吸附色谱、分配色谱、分子排阻色谱及离子交换色谱法，其他还有胶束色谱法、化学键合色谱法及亲和色谱法等类别。在液相检验中，分离是核心，而色谱是一种分离分析手段。无论是那种分离方法，其分离试验方法都是一个物理过程，与液相层析的试验方法相似：将要检测分析的化合物通过进样器放入液相色谱仪，流动相携带着其流过色谱柱，由于不同物质在固定相上的保留时间不同出现的峰高或者峰面积定量以及出峰时间的不同而达到分离，从而或检测**中不同成分的含量、或分析药效，或测定**残留物杂质成分的浓度。

　　**含量检验中液相色谱的应用

　　**含量检验中定量分析的准确与否，关键在于检测器所产生的信号是否与被测样品的量始终呈**的函数关系。液相色谱仪可使输出信号与样品量好呈线性关系，这样进行定**含量测定时既准确又方便。

　　例如，示差检测法就是用液相色谱测定多糖类**，用电化学检测器检测的阴离子交换柱分离出多糖类**，这种方法优于传统检验法，可直接对低浓度糖作定量分析，不需衍生和样品处理，在节约时间和资金的同时避免了有毒衍生试剂的使用。在检验中不同类型的糖(如单糖、糖胺聚糖、半乳糖、果糖等)适用于不同的离子交换柱。

　　药效检验中液相色谱的应用

　　**的**效果取决于人体对**的吸收，与**成分及其代谢物在血液中的浓度有关。随着现代**的选择性越来越高，所服用的剂量越来越低，这就需要提高药效。现阶段药效临床试验中采用人肝组织，选择液相色谱法检测药性药效，对混合物中微量组分进行结构分析，可搭配固定相和流动相以达到好的分离效果。

　　例如，用内标法检测血液中**浓度的总量限度。内标法是液相色谱的一种常用测定方法。首先提取血液，然后根据规定的方法配制不含**的溶液，注入到液相色谱仪中，记录为色谱图I，然后再配制含有**的溶液，以相同的条件注样，记录为色谱图II。然后将图I与图II进行比较，则可以通过杂质峰确认杂质峰的面积，从而达到检验的效果。

　　**残留中液相色谱的应用

　　通常**在使用一段时间后在体内产生残留物会影响认得某些生理功能，也就是人们所说的食药三分毒，如何分析**残留物成分，减少其引起的不必要危害，液相色谱法起到了重要的作用。质谱仪是完成**代谢物毒性鉴定的主要工具，是制药工业中毒理学试验的基础。

　　今后的医药分析检验研究中，可以应用液相色谱法不受试样挥发性限制等优点，结合其它的先进技术，如色谱——光谱联用、柱切换技术、傅立叶变换红外线吸收光谱联用等，不断提高液相色谱在液相检验中的应用。

　　液相色谱仪分离的目的必须**明确，下面的问题在建立方法之初就应确定：　　（1）主要目的是什么？定量或定性，还是定性、定量同时做？；　　（2）是否有必要解析出样品的所有成分？譬如可能有必要分离出产品中的所有降解物或杂质，以使含量测定结果更加可靠，但却没必要将它们彼此**分开。　　（3）如要求定量分析，准确度与精密度需多大？样品主要成分的精密度通常能达到±1—2%，特别是不需样品预处理的情况。　　（4）特殊化合物可能会以不同的样品形式出现（如：原料药，一种或多种形态，环保样品等）。是否需要一种以上的HPLC方法？单一方法分离不同形态样品是否理想？　　（5）一次将分析多少样品？当必须同时处理大量样品时，运行时间将变得非常重要。　　有时甚至为了缩短运行时间而以牺牲样品分离度作代价，如缩短柱长或加快流速。当一次分析的样品数目超过10个，运行时间一般应控制在20min以内。　　（6）将要使用该方法的实验室中，有哪些HPLC设备？色谱柱能否恒温系统能否做梯度洗脱？该方法是否可在不同设计与生产的设备上运行？　　方法建立实验开始之前，应明确对方法的这些要求。