液相色谱仪使用中的注意事项 液相色谱使用方法

　　【***** 使用手册】液相色谱仪(HPLC)现已成为有机化学分析的重要手段之一。和其它分析仪器一样，想要HPLC很好地为你工作、得到可靠的数据，首先你要保养好它，使它处于一个良好的待机状态，这样你操作它进行分析时就可以比较顺利地获得理想的结果。而且良好规范的操作习惯可以延长仪器使用寿命。笔者将从液相色谱仪使用中的几个注意事项进行讨论，给新从事HPLC分析的工作者一点操作建议，希望能对大家进行正确的操作仪器起到帮助。　　基本操作　　1). 严格过滤色谱纯流动相，根据需要选择不同的滤膜。　　2). 对抽滤后的流动相进行超声脱气20～30分钟。　　3). 打开色谱工作站，连接好流动相管道，连接检测系统。　　4).有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，冲洗时速度不要超过10ml/min。　　5). 调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000psi。选用合适的流速。　　6). 设定不同样品的检测器分析参数。　　7). 等基线走稳即可进样分析，分析样品时对样品的前处理非常重要。　　8).关机时，先关检测器，泵不要关掉，应改用流动相冲洗泵，不同的流动相冲洗时间不同，一般冲洗30min，若是缓冲盐作流动相应先用水冲洗30min，再用纯甲醇冲洗。　　9). 然后关液相泵。　　10). 需要把进样阀冲洗干净，另把注射器等工具清理整洁。　　注意事项　　一、加装保护柱　　保护柱的作用是过滤掉来自流动相和样品的化学“拉圾”同时也可以有效除去流动相和样品中的不溶物。尽管现在的色谱仪在流动相吸入口、进样阀后部以及在色谱柱的两端都装有1、2μm等不同孔径的滤器,但滤器只能除去不溶性颗粒而不能除去化学污然,因此,加装保护柱是必要的,特别是在分析中药、中成药等复杂混合物和生物样品时更是保护分析柱必不可少的措施。　　二、过滤流动相和样品　　流动相通常由水或缓冲溶液与有机溶剂混合而成,原则上,所有经过色谱柱的流动相均应过滤,但在实际操作上应视具体情况而有所区别:当有机溶剂用色谱纯级,水用石英亚沸水或其它超纯水时,在能确保水和有机溶剂的质量且没有受到污染时,过滤并无更多实际意义。　　三、净化样品　　当样品中含有对色谱柱有损害的化学成分,如产生*性吸附的蛋白质、糖等有机分子和强吸附性物质,以及可能对柱填料产生破坏作用的基团离子。在进样前应尽可能对样品进行分离提纯以除去多余杂质组分。　　四、避免过高的柱压　　虽然液相色谱柱能耐受的压力可达6000 p si (磅/平方英寸) ,但过高及过大的压力变化均会缩短色谱柱的寿命,避免的方法是　　(1)柱压过高时,尽可能采用较小的流速,以不超过柱zui大允许压力的一半为宜。　　( 2)当流速较大时,应采取流速梯度的办法使流速分步到位。　　(3)使用手动进样阀时,进样阀的切换要尽可能的快。否则超过20%的压力冲击会很快使柱报废。当使用多柱联用时,柱切换要避免在高压下进行。　　五、正确及时的冲洗　　开始试验前,应了解柱中当前是何种溶剂。对于新色谱柱,如无特殊说明均为评价报告中所用流动相。柱中当前溶剂**要与分析样品所用流动相互溶,如不能混溶,要用与二者均能相互混溶的第三种溶剂过渡。 制备液相色谱故障排查及解决方案

　　制备液相色谱中，有三个可以观察到的状态：柱压、检测器基线、谱图。通过观察和记录这三个状态可以监测仪器是否正常。若某个状态出现异常，故障排查和解决方案如下。

　　1、柱压波动

　　1）吸液管路进气泡

　　①溶剂不足，吸滤头吸入空气，添加溶剂并排气泡。

　　②吸滤头脏了或堵塞，用异丙醇（或5%稀硝酸）清洗。

　　③溶剂中有气泡（尤其两种以上溶剂混合），超声（或抽滤）脱气。

　　2）泵流量不稳

　　①单向阀堵塞，大流速purge，若不能解决，则需拆下单向阀（异丙醇）超声清洗清洗或更换单向阀。

　　②柱塞密封圈磨损，更换密封圈。

　　③泵头污染，柱塞杆往复活动受阻，清洗泵头。

　　3）柱床塌陷，维修或更换色谱柱。

　　4）流动相混合后吸放热导致温度变化，以致柱压波动，如乙腈和水混合吸热，甲醇和水混合放热。若影响实验结果，则增加柱温箱或流动相预混。

　　2、柱压升高或超压。

　　逐段排查堵塞的位置：

　　1）先拆下色谱柱，接上两通运行，若是色谱柱堵塞：

　　①进样后样品析出，用合适的溶剂反冲色谱柱。

　　②缓冲盐析出，用大比例水相的流动相冲洗色谱柱。

　　③机械杂质堵塞筛板，异丙醇小流速反冲色谱柱。

　　④色谱柱污染严重，需维修或充填。

　　2）混合器堵塞，维修或更换。

　　3）六通阀堵塞，将泵液管路接到连接色谱柱的阀口处，将阀扳至load状态，用易溶样品的溶剂小流速冲洗。

　　4）压力传感器故障，维修或更换。

　　3、检测器基线波动

　　1）基线有规律波动，且幅度较大，则可能有气泡持续进入流通池。排查气泡来源并用异丙醇冲洗检测器或色谱柱。

　　2）基线小幅度规律波动，可能是检测器灯能量不足（能量下降后，低波长下灵敏度先下降。

　　3）基线漂移。

　　①流动相在此检测波长下有吸收。更换流动相或改变波长。

　　②色谱柱或检测池污染。以异丙醇冲洗色谱柱或检测池，或将检测池中透镜玻片取出清洗。

　　4、谱图重现性差

　　1）检查方法设置，包括流速、梯度、波长。

　　2）检查流动相配置是否有误，A、B两相是否放反。

　　3）检查柱压与之前是否有差异，若有变化，则前面1和2进行排查。

　　4）进样前色谱柱是否**平衡好。

　　5）样品溶解方法。