暗视场显微镜工作方法及注意事项 显微镜使用方法

　　【*** 使用手册】暗视场显微镜：使用特殊的暗视场聚光镜使照明光线偏移而不进入物镜，只有样品的散射光进入物镜。　　　　注意事项　　　　1、制作暗视场光挡时，若光挡直径过小或光挡的**位置不正，则不能**挡掉直射光，视野不暗，样品与背景的明暗反差不明显;若光挡直径过大，聚焦到样品上的光线不足，使暗视野显微镜观察到的样品亮度不佳，影响观察效果。　　　　2、使用暗视野显微镜时，照明光源的照明强度要高，否则样品的反射光强度不够，影响观察效果。　　　　3、若视场中样品与背景明暗反差不强时，可以上下调节聚光器的位置，使视场内的反差提高。　　　　4、要求使用的载玻片和盖玻片必须无划痕且无灰尘，物镜前透镜也必须清洁无尘。载玻片与盖玻片的厚度应符合标准。载玻片太厚，聚光器的焦点将落在载玻片内，达不到被检物体的平面上;使用油镜头时，由于物镜的工作距离很短，甚至无法调焦，从而看不到或看不清被检物体。　　　　5、载玻片的厚度要适宜，照明光束经暗视野显微镜聚光器后，产生空心照明光锥，即**为暗区。而反射光的焦点在聚光器上透镜表面之上，很短的距离。因此，载玻片的适宜厚度为0.8～1.2mm。　　　　6、物镜的数值孔径必须小于聚光器的数值孔径，否则会因物镜的孔径角大于暗视野显微镜聚光器所形成的照明光束**暗区的角度，致使部分照明光线射入物镜，破坏或降低了暗视场的照明。　　　　7、暗视野显微镜镜检时室内要暗，如果没有这样的条件，应尽可能使用遮光装置，以阻止目镜周围的光线射入。　　　　8、在进行油镜镜检时，由于油内的杂质和气泡的漫反射，会妨碍暗视野显微镜镜检效果，所以要求尽可能地除掉油内的杂质和气泡。　　　　工作试验方法　　　　暗视场显微镜在构造上应用丁达尔现象（Tyndall phenomenon:当聚光光束射入溶胶时，从光束的侧面可以看到一条发亮的光柱，在光的传播过程中，光线照射到粒子时，如粒子直径略小于入射光波长，则发生光的散射，每个微粒就成为一个发光点，从侧面可以看到一条光柱。），装配了一类特殊聚光器——暗视场聚光器，使入射光束，从聚光器斜向照明被检样品。由于照明光线与显微镜光轴形成较大的角度通过物场，或因聚光器的特殊构造，照明光线在聚光器顶透镜或盖片的上表面发生全反射，致使照明光线不能入射物镜之内。但是，样品被照明并发出反射光。镜检时，因不能直接观察到照明光线，与光轴垂直的平面视场暗黑，在深暗的背景上能清晰地看到由散射光和反射光形成的明亮的物体影像，物像与背景造成很大的反差。视场内的样品，被斜射光线照明，可从样品各种结构表面散射和反射光线，看到许多细胞器的明亮轮廓，诸如细胞核、线粒体、液泡以及某些内含物等。如果是正在分裂的细胞，其各类纺锤丝和染色体亦可窥见。　　　　暗视场显微镜是利用样品的散射光和反射光进行观察，所以只能看到物体的存在与运动而不能辨清其微细结构。暗视场显微镜的检测能力，取决于入射光的强度和视场的反差，后者又随微粒及其背景的折射率差别的加大而增加。　　　　暗视场显微镜与普通光学显微镜的区别，主要在于聚光器的不同，致使照明方法有别。确切地说，称暗视场显微镜为暗视场照明更为贴切。暗视场照明是斜向照明的一种，这种照明法能提高对微小物体的分辨能力，对大小在0.004μm以上的微小粒子，尽管看不清楚其结构，亦可清晰地分辨其存在和运动。 关于电子显微镜的放大倍率说明

人类认识自然界大部分信息来自眼睛，在对周围世界的认识中，总是希望看到细微的细节。众多微观世界的结构需要能够分辨，并达到人裸眼分辨的状态，才能够正常观察。由于正常人眼在25cm明视状态下，能够分辨的距离是0.2mm,因此可以使用放大镜将物体放大来观察物体的细节。例如，用10倍的放大镜可以将两个质点间的距离放大10倍，肉眼即可以分辨出0.02mm之间的两点，使物体看得更清晰。但放大镜的倍数有限，不能达到更高的分辨率。因此，分辨本领和放大倍率成为电子显微镜要的两大基本问题。此文**已放大倍率为主题，展开详细介绍： 放大倍率也是显微镜性能的一种指标。电子显微镜不仅需要有***佳的分辨本领，还需要有合理的放大倍率。只有通过合理地放大，人眼才能依靠电子显微镜的***佳分辨本领区分精细的物体和结构。 放大镜是凸透镜，其形状为中间厚，边缘薄。光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，则发生折射现象，使光线向中间汇聚。折射、聚焦是放大镜的基本试验方法。当用放大镜观察物体时，眼睛在放大镜上面，物体放在放大镜下面。物体的光线穿过时，发生折射，使光线向中间汇聚，进入人眼。物体在人眼视网膜上所成像的大小与物体对眼所张的角成正比。视角愈大，像也愈大，愈能分辨物体的细节。

放大镜工作试验方法

光学显微镜的物镜，目镜及聚光镜等部件均由单个和多个透镜组成。仪器总放大倍率是仪器各透镜放大率的乘积，以光镜为例：

放大倍率

式中,ML为总放大倍率，MO为物镜放大倍率，Me为目镜放大率。用油浸物镜时，光镜总放大倍率为：

放大倍率

如果增大Mo或透镜数目，总放大倍率ML尚可增大，结果像虽然增大，但却是模糊不清的。这种无意义的放大，称空放大，确切地说就是超过有效放大率的放大称为空放大。 有效放大率由式得出：

有效放大率

分辨本领为2埃的电镜有效放大率：

有效放大率

即100万倍，比光镜大1000倍。 根据以上式中可以得出，有效放大率由分辨本领所决定，而分辨本领又是仪器仪表***基本的性能指标，若低于有效放大率则仪器没有**发挥其性能。若高于放大倍率就成无意义的放大了。